Брожение – примитивный энергетический процесс расщепления глюкозы до ПВК. Образуется в цитоплазме.
Признаки Б. :
Низкий энергетический выход
Сустратный тип фосфорилирования
Акцептор – органические вещества.
В зависимости от конечного продукта выделяют:
Молочнокислое б. – лакто/бифидо бактерии, стрептококки;
Маслянокислое б. – споробразные бактерии
Пропионово-кислое б. – одноклеточные бактерии
Спиртовое брожение – дрожжи рода S.
Дыхание – совершенный энергетический процесс окисления до СО2 и Н2О.
Признаки дыхания:
Высокий энергетический выход (38 АТФ из 1 молекулы глюкозы)
Мембранный тип фосфорилирования (т.е. в лизосомах)
Реакции протекают межмолекулярно
Акцептор – О2 и органические вещества.
Состоит из нескольких этапов:
1) Гликолиз – в цитоплазме клеток образуется ПВК и высвобождаются две молекулы АТФ
2) ЦТК (Цикл Креббса) – влизосомах – ПВК окисляются до СО2 , Н2О, высвобождают 36 молекул АТФ
3) Реакции протекают межмолекулярно
4) Акцептор О2 и органические вещества.
По типу дыхания:
Облигатные (строгие) аэробы развиваются при наличии в атмосфере 20% кислорода (микобактерии туберкулеза), содержат ферменты, с помощью которых осуществляется перенос водорода от окисляемого субстрата к кислороду воздуха.
Микроаэрофилы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода, и его высокая концентрация хотя и не убивает бактерии, но задерживает их рост (актиноисцеты, бруцеллы, лептоспиры).
Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии, так и в отсутствие кислорода (большинство патогенных и сапрофитных микробов - возбудители брюшного тифа, паратифов, кишечная палочка).
Облигатные анаэробы - бактерии, для которых наличие молекулярного кислорода является губительным (клостри-дии столбняка, ботулизма).
Аэробные бактерии в процессе дыхания окисляют различные органические вещества (углеводы, белки, жиры, спирты, органические кислоты и пр.).
Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии. Процессы разложения органических веществ в безкислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют брожением. В зависимости от участия определенных механизмов различают следующие виды брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами, молочно-кислое, вызываемое мол очно-кислыми бактериями, масляно-кислое и пр.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо создание бескислородных условий, достигаемое различными методами.
Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах - анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика сахарного агара или среды Вильсона - Блера, налитых в пробирки в расплавленном состоянии и остуженных до 43°С. По методу Вейона - Виньяля расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.
Химические методы заключаются в том, что при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. В жидкие питательные среды можно добавлять различные редуцирующие вещества: аскорбиновую или тиогликолевую кислоту.
Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закупоренных. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта - Тароцци. В нее входят сахарный МПБ, который наливают в пробирки в количестве 10-12 мл, и кусочки вареных паренхиматозных органов. Перед употреблением среду Китта,- Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного в ней кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов (помутнение) может наблюдаться через 48 ч и более в зависимости от количества посевного материала.

Рост изолированных колоний анаэробов можно получить при рассеве исследуемого материала по поверхности кровяно-сахарного агара, разлитого в чашки Петри. После посева чашки помещают в анаэростат. Исследуемый материал в убывающей концентрации можно засевать в высокий столбик агара. Образовавшиеся отдельные колонии анаэробов выделяют, распилив пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного количества биомассы отсевают затем на среду Китта - Тароцци. В качестве источника энергии для анаэробов используют глюкозу, добавление которой в питательную среду обязательно.

11. Ферменты бактерий. Классификация ферментов: 1) по химической природе; 2) по генетическому контролю. Методы изучения ферментативной активности бактерий и ее использование для идентификации бактерий.
1) По химической природе
* Оксиредуктазы – катализируют ОВР
* Трансферазы – ускоряют ракции перноса атомов в ЦТК и ПФЦ.
* Гидролазы – ускроение гидролитического расщепления белков и углеводов.
Ферменты агрессии:
Гиалуронидаза – расщепляет гиалиновую кислоту соединительной ткани
Нейраминидаза – нейраминовую кислоту слизистых
Коллагеназа – коллаген мышечных волокон (преим. Для клостридий)
Лецитиназа – лецитин мембран эритроцитов и мышечных волокон
Протеиназа – расщепляет иммуноглобулины.
Лиаза – участвует в реакциях расщепления двойных связей или присоединенеия по двойным связям
Изомеразы – обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров
ЛиГазы (синтетазы) – р-ии биосинтеза белка.

2) По генетическому контролю:
Конститутивные – синтезируются в течение всей жизни МО
Адаптивные (индуцибельные) – синтез адаптируется с одним субстратом
Репрессибельные – синтез угнетается избирательным накоплением продуктов реакции.
Эндоферменты – Функционируют внутри клетки
Экзоферменты – выделяются в окружающую среду (гидролазы).
Набор ферментов строго индивидуален для вида.

Изучение биохимических свойств бактерий проводится на дифференциально-диагностических средах (Эндо, Левина, Плоскирева, Ресселя, Гисса и др.).

Дифференциально-диагностические среды делятся на три группы:

1. среды для выявления протеолитических свойства бактерий (МПБ, мясо-пептонный желатин);
2. среды для изучения ферментации углеводов (Эндо, Плоскирева, Гисса, Ресселя);
3. среды для определения гемолитических свойств (кровяной агар).

Изучение протеолитических свойств проводиться с помощью индикаторов, позволяющих обнаруживать образование сероводорода, индола и т.д. при расщеплении белка. Для этого используют индикаторы ацетата свинца (на сероводород) и щавелевой кислоты (на индол). Индикаторы при их использовании изменяют цвет: при выделении сероводорода – чернеют, при выделении индола – краснеют. Для определения ферментации углеводов используются среды Гисса, в состав которых входят глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза, сахароза и индикатор Андреде (карболовый фуксин, обесцвеченный содой). При ферментации того или другого углевода среда краснеет. (ПРИМЕРЫ)

Рост бактерий – увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции.

Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения.

Рост всегда предшествует размножению. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние.

Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. В точке прикрепления хромосомы к цитоплазматической мембране (точке-репликаторе) действует белок-инициатор, который вызывает разрыв кольца хромосомы, и далее идет деспирализация ее нитей. Нити раскручиваются, и вторая нить прикрепляется к цитоплазматической мембране в точке-прорепликаторе, которая диаметрально противоположна точке-репликатору. За счет ДНК-полимераз по матрице каждой нити достраивается точная ее копия. Удвоение генетического материала – сигнал для удвоения числа органелл. В септальных мезосомах идет построение перегородки, делящей клетку пополам.

Двухнитевая ДНК спирализуется, скручивается в кольцо в точке прикрепления к цитоплазматической мембране. Это является сигналом для расхождения клеток по септе. Образуются две дочерние особи.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток – колонии, различные по размерам, форме, поверхности, окраске и т. д. На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения или осадка.

Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др.

Фазы размножение бактериальной клетки на жидкой питательной среде:

1) начальная стационарная фаза; то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится;

2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3–4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК;

3) фаза логарифмического размножения; активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью;

4) максимальная стационарная фаза; бактерии достигают максимальной концентрации, т. е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит;

5) фаза ускоренной гибели; процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества.

Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки.

Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены – это восемь химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 10-4 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций.

Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.

Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ.

В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на:

1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО2);

2) гетеротрофы;

3) метатрофы (используют органические вещества неживой природы);

4) паратрофы (используют органические вещества живой природы).

Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки.

По источникам энергии микроорганизмы делят на:

1) фототрофы (способны использовать солнечную энергию);

2) хемотрофы (получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций);

3) хемолитотрофы (используют неорганические соединения);

4) хемоорганотрофы (используют органические вещества).

Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост.

Среди бактерий выделяют:

1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества из низкоорганизованных);

2) ауксотрофы (являются мутантами прототрофов, потерявшими гены; ответственны за синтез некоторых веществ – витаминов, аминокислот, поэтому нуждаются в этих веществах в готовом виде).

Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений.

Метаболиты и ионы поступают в микробную клетку различными путями.

Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку.

1. Пассивный транспорт (без энергетических затрат):

1) простая диффузия;

2) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков).

2. Активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны).

Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией.

Особенности метаболизма у бактерий:

1) многообразие используемых субстратов;

2) интенсивность процессов метаболизма;

4) преобладание процессов распада над процессами синтеза;

5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма.

В процессе метаболизма выделяют два вида обмена:

1) пластический (конструктивный):

а) анаболизм (с затратами энергии);

б) катаболизм (с выделением энергии);

2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах):

а) дыхание;

б) брожение.

В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Для аэробов акцептором является кислород. Факультативные анаэробы в кислородных условиях используют процесс дыхания, в бескислородных – брожение. Для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки.

В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами. По строению выделяют:

1) простые ферменты (белки);

2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов.

Различают также:

1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата);

2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата).

Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.

По месту действия выделяют:

1) экзоферменты (действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий);

2) эндоферменты (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ).

В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов:

1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами);

2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп);

3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей);

4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции);

5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров);

6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ).

Основными видами пластического обмена являются:

1) белковый;

2) углеводный;

3) липидный;

4) нуклеиновый.

Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты.

Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением.

В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот. Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования. В белковом обмене процессы синтеза преобладают над распадом, при этом происходит потребление энергии.

В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения.

В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения:

1) спиртовое (характерно для грибов);

2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий);

3) молочнокислое (характерно для стрептококков);

4) маслянокислое (характерно для сарцин);

5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл).

Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.). Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями.

Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз.

Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА.

Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов.

Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода.

Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот имеет значение для процесса деления клетки. Синтез осуществляется с помощью ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимой-РНК-полимеразы.

Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК по материнской. ДНК-зкависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК.

Физиология бактерий

Физиология бактерий изучает жизнеде­ятельность, метаболизм бактерий, вопросы питания, получения энергии роста и размно­жения бактерий, а также их взаимодействие с окружающей средой. Метаболизм бактерий лежит в основе изучения и разработки мето­дов их культивирования, получения чистых культур и их идентификации. Выяснение фи­зиологии патогенных и условно-патогенных бактерий важно для изучения патогенеза вы­зываемых ими инфекционных болезней, для постановки микробиологической диагности­ки, проведения лечения и профилактики ин­фекционных заболеваний, регуляции взаимо­отношения человека с окружающей средой, а также для использования бактерий в биотех­нологических процессах с целью получения биологически активных веществ.

Химический состав бактериальной клетки.

Бактериальная клетка на 80-90 % состоит из воды , и только 10% приходится на долю сухого вещества. Вода в клетке находится в свободном или связанном состоянии. Она выполняет механическую роль в обеспечении тургора, участвует в гидролитических реакци­ях. Удаление воды из клетки путем высуши­вания приводит к приостановке процессов метаболизма, прекращению размножения. Высушивание микроорганизмов в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение микробов и спо­собствует длительному их сохранению.

Состав сухого вещества распределен следу­ющим образом:

52 % составляют белки, 17 % - углеводы, 9 % - липиды, 16 % - РНК, 3 % - ДНК и 3 % - минеральные вещества.

Белки являются ферментами, а также со­ставной частью клетки, входят в состав цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и ее производных, клеточной стенки, жгутиков, спор и некоторых капсул. Некоторые бактериальные белки являются антигенами и токсинами бак­терий. В состав белков бактерий входят от­сутствующие у человека Д-аминокислоты, а также диаминопимелиновая кислота.

Углеводы представлены в бактериальной клетке в виде моно-, ди-, олигосахаров и полисахаридов, а также входят в состав ком­плексных соединений с белками, липидами и другими соединениями. Полисахариды нахо­дятся в составе некоторых капсул, клеточной стенки; крахмал и гликоген являются запас­ными питательными веществами. Некоторые полисахариды принимают участие в форми­ровании антигенов.

Липиды или жиры входят в состав ЦПМ и ее производных, клеточной стенки гра мотрицательных бактерий, а также служат запасными веществами, входят в состав эн­дотоксина грамотрицательных бактерий, в составе ЛПС формируют антигены . В бак­териальных жирах преобладают длинноцепочечные (С 14-С18) насыщенные жирные кислоты и ненасыщенные жирные кислоты, содержащие одну двойную связь. Сложные липиды представлены фосфатидилинозитом. фосфатидилглицерином и фосфатидилэтаноламином. У некоторых бактерий в клетке находятся воски, эфиры миколовой кислоты . Микоплазмы - единственные представители царства Procaryotae , имеющие в составе ЦПМ стеролы. Остальные бактерии в составе ЦПМ и ее производных не имеют стеролов.

Нуклеиновые кислоты . В бактериальной клетке присутствуют все типы РНК: иРНК, тРНК, рРНК. Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды - это те строительные блоки, из которых синтезируются нуклеиновые кисло­ты. Кроме того, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды входят в состав многих кофермен-тов и служат для активации и переноса амино­кислот, моносахаров, органических кислот.

ДНК выполняет в бактериальной клетке на­следственную функцию. Молекула ДНК постро­ена из двух полинуклеотидных цепочек. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара дезоксирибозы и фосфатной группы (рис. 3.1, а). Азотистые основания представле­ны пуринами(аденин, гуанин) и пиримидинами (тимин, цитозин). Каждый нуклеотид обладает полярностью. У него имеется дезоксирибозный З"-конец и фосфатный 5"-конец. Нуклеотиды со­единяются в полинуклеотидную цепочку пос­редством фосфодиэфирных связей между 5"-кон-цом одного нуклеотида и З"-концом другого. Сцепление между двумя цепями обеспе­чивается водородными связями между компле­ментарными азотистыми основаниями: аденина с тимином, гуанина с цитозином. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположен 5"-конец одной цепи и З"-конец другой цепи. Процентное содержание количества гуанинцитозин(ГЦ)-пар в ДНК определяет степень родства между бактери­ями и используется при определении таксономи­ческого положения бактерий.

Минеральные вещества обнаруживаются в золе, полученной после сжигания клеток. В большом количестве представлены мине­ральные вещества: N, S, Р, Са, К, Mg, Fe, Mn, а также микроэлементы: Zn, Си, Со, Ва.

Азот входит в состав белков, нуклеотидов, коферментов. Сера входит в виде сульфгид-рильных групп в структуру белков. Фосфор в виде фосфатов представлен в нуклеиновых кислотах, АТФ, коферментах. В качестве ак­тиваторов ферментов используются ионы Mg, Fe, Mn. Ионы К и Mg необходимы для акти­вации рибосом. Са является составной частью клеточной стенки грамположительных бакте­рий. У многих бактерий имеются сидерохро- мы, которые обеспечивают транспортировку ионов Fe внутрь клетки в виде растворимых комплексных соединений.

"Классификация бактерий по типам питания и способам получения энергии.

Основной целью метаболизма бактерий является рост, т. е. коор­динированное увеличение всех компонентов клетки. Поскольку основными компонентами бактериальной клетки являются органические соединения, белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды, остов которых построен из атомов углерода, то для роста требуется посто­янный приток атомов углерода. В зависимости от источника усвояемого углерода бактерии подразделяют по типам на:

ауготрофы, которые используют для построения своих клеток неорганический углерод, в виде СО,; гетеротрофы (от феч. heteros - другой), которые используют органический углерод. Легко усвояемыми источниками органи­ческого углерода являются гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты.

Белки, жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты являются крупными полимерными молекулами, которые синтезируются из мо­номеров в реакциях поликонденсации, про­текающих с поглощением энергии. Поэтому для восполнения своей биомассы бактериям помимо источника углерода требуется источ­ник энергии. Энергия запасается бактериаль­ ной клеткой в форме молекул АТФ.

Организмы, для которых источником энергии является слет, называются фототрофами. Те организмы, которые получают энергию за счет окислительно-восстановительных реак ций , называются хемотрофами.

Среди хемотрофов выделяют литотрофы (от греч. lithos - камень), способные использо­вать неорганические доноры электронов (Н 2 , NH 3 , H 2 S, Fe 2+ и др.) и органотрофы, которые используют в качестве доноров электронов органические соединения.

Бактерии, изучаемые медицинской мик­робиологией, являются гетерохемоорганот рофами . Отличительной особенностью этой группы является то, что источник углерода у них является источником энергии. Учитывая разнообразие микромира и типов метаболиз­ма, далее изложение материала ограничено рассмотрением метаболизма у гетерохемоорганотрофов.

Транспорт веществ в бактериальную клетку

Для того, чтобы питательные вещества мог­ли подвергнуться превращениям в цитоплаз­ме клетки, они должны проникнуть в клетку через пограничные слои. Ответственность за поступление в клетку питательных веществ лежит на ЦПМ.

Существует два типа переноса веществ в бак­териальную клетку:

пассивный

активный.

При пассивном переносе вещество прони­кает в клетку только по градиенту концентра­ции. Затрат энергии при этом не происходит. Различают две разновидности пассивного пе­ реноса :

простую диффузию

облегченную диффузию.

Простая диффузия - неспецифи­ческое проникновение веществ в клетку, при этом решающее значение имеет величина мо­лекул и липофильность. Скорость переноса незначительна.

Облегченная диффузия проте­кает с участием белка-переносчика. Скорость этого способа переноса зависит от концентра­ции вещества в наружном слое.

При активном переносе вещество про­никает в клетку против градиента концен­трации при помощи белка-переносчика - пермеазы. При этом происходит затрата энергии . Имеется два типа активного транс­ порта. При одном типе активного транс порта небольшие молекулы (аминокислоты, некоторые сахара) «накачиваются» в клетку и создают концентрацию, которая может в 100-1000 раз превышать концентрацию этого вещества снаружи клетки. Второй ме­ханизм, получивший название транслока­ ция радикалов, обеспечивает включение в клетку некоторых сахаров (например, глю­козы, фруктозы), которые в процессе пе­реноса фосфорилируются, т. е. химически модифицируются. Для осуществления этих процессов в бактериальной клетке лока­лизуется специальная фосфотрансферная система, составной частью которой является белок-переносчик, находящий­ся в активной фосфорилированной фор­ме. Фосфорилированный белок связывает свободный сахар на наружной поверхности мембраны и транспортирует его в цитоплаз­му, где сахар освобождается в виде фосфата. Поступив в клетку, органический источник углерода и энергии вступает в цепь биохимичес­ких реакций, в результате которых образуются АТФ и ингредиенты для биосинтетических про­цессов. Биосинтетические (конструктивные) и энергетические процессы протекают в клетке одновременно. Они тесно связаны между собой через общие промежуточные продукты, кото­рые называются амфиболитами.

Культивирование бактерий в системах in vi ­ tro осуществляется на питательных средах. Искусственные питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

Каждая питательная среда должна со­ держать воду , так как все процессы жизнеде­ятельности бактерий протекают в воде.

Для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органи­ческие соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюко­за, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингре­диентов для биосинтетических путей. Часто используется в этих целях пептон - продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-,олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков.

Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источни­ки азота, серы, фосфаты и другие минераль­ные вещества, в том числе микроэлементы.

Источником азота может служить пептон; кроме того, большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источ­ника азота.

Серу и фосфор бактерии способны утили­зировать в виде неорганических солей: суль­фатов и фосфатов.

Для нормального функционирования фер­ментов бактериям требуются ионы Са 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов.

4. Решающее значение для роста мно­гих микроорганизмов имеет рН среды. Поддерживание определенного рН имеет значение для предотвращения гибели мик­роорганизмов от ими же образованных про­дуктов обмена. С этой целью питательную среду забуферивают, чаще всего используя фосфатный буфер. При сильном выделении бактериями кислот, как продуктов обмена, добавляют к питательной среде карбонат кальция СаС1 2 .

5. Среда должна обладать определенным ос­ мотическим давлением. Большинство бакте­рий способны расти на изотоничных средах, изотоничность которых достигается добавле­нием NaCl в концентрации 0,87 %. Некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1 %. Такие бактерии называются галофильными.

Так как устойчивость к осмотическому дав­лению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, бактерии, лишенные кле­точной стенки, микоплазмы L-формы могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно сахарозы.

При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для дейс­твия ферментов, индикаторы.

6 . Питательные среды должны быть сте­ рильными.

В зависимости от консистенции питатель­ ные среды могут быть:

1. полужидки­ми

   плотными.

Плотность среды достигается добавлением агара.

Агар - полисахарид, получаемый из водо­рослей. Он плавится при температуре 100 °С, но при охлаждении остывает при температу­ре 45-50 °С. Агар добавляют в концентрации 0,5 % - для полужидких сред и 1,5-2 % - для создания плотных сред.

В зависимости от со­става и цели применения различают:

2. элективные,

   минимальные,

   диффе­ренциально-диагностические

   комбинирован­ные среды.

По составу питательные среды могут быть простыми и сложными.

К простым средам от­носятся пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар.

На основе этих простых сред готовят сложные, например сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар.

В зависимости от назначения среды под­разделяются на элективные, обогащенные, дифференциально-диагностические.

Под элективными понимают среды, на ко­торых лучше растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9, служит для выделения холер­ного вибриона. Другие бактерии, в частности кишечная палочка, из-за высокого рН на этой среде не растут.

Среды обогащения - это такие среды, кото­рые стимулируют рост какого-то определен­ного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, среда, содержащая селенит натрия, стимулирует рост бактерий рода Salmonella , ингибируя рост кишечной палочки.

среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой пи­тательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результа­те ферментативного превращения субстрата. Примером таких сред являются среды Гисса, используемые для изучения способности бак­терий ферментировать сахара.

Комбинированные питательные среды со­четают в себе элективную среду, подавля­ющую рост сопутствующей флоры, и диф­ференциальную среду, диагностирующую ферментативную активность выделяемого микроба. Примером таких сред служат среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар, ис­пользуемые при выделении патогенных ки­шечных бактерий. Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки.

Питательные среды . Применяют для выращивания (культи­вирования) микроорганизмов в лабораторных или промышлен­ных условиях. Любая питательная среда должна отвечать сле­дующим требованиям:

иметь оптимальные для бактерий физико-химические свойства: рН, влажность, осмолярность и др.

Для жизнедеятельности микробной клетки, безусловно, не­обходима вода как основной растворитель и среда для проте­кания всех биохимических реакций.

В бактериологической практике используют среды, различ­ные по происхождению.

Синтетическими питательными сре­дами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Пре­имуществом синтетических сред являются их строго постоян­ный состав и воспроизводимость.

Полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями переработанные нативные компоненты неопределенного состава - гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д.

Натуральные питательные среды представляют собой неизмененные натив­ные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).

Различные потребности микробов отдельных видов обуслов­ливают большое разнообразие питательных сред.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Для придания плотной консистен­ции к жидкой среде добавляют агар-агар, представляющий собой продукт переработки особого вида морских водорослей. Агар-агар плавится при 80-86 °С, затвердевает при темпера­туре около 40 "Сив застывшем состоянии придает среде плот­ность. В плотные среды добавляют 1,5-2 %, в полужидкие - 0,3-0,7 % агар-агара. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют нативные компоненты (свернувшаяся сыворотка крови, свернувшийся яичный белок), которые сами по себе являются плотными.

Преимуществом плотных питательных сред является воз­можность получения чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газо­нов), имеющих макроскопические размеры.

По целевому назначению питательные среды делят на основ­ные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращива­ния многих бактерий. Это пептические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду - питательный бульон и плотную - пи­тательный агар. Такие среды также служат основой для приго­товления сложных питательных сред - сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов опреде­ленного вида (или определенной группы) из материалов, со­держащих разнообразную постороннюю микрофлору. При со­здании элективных питательных сред исходят из биологичес­ких особенностей, которые отличают данные микробы от боль­шинства других. Например, избирательный рост стафилокок­ков наблюдается при повышенной концентрации хлорида на­трия, холерного вибриона - в щелочной среде и т.д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред осно­ван на различиях в биохимической активности бактерий раз­ных видов вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, б) определенный углевод (например, лактоза), способность использовать который явля­ется диагностическим признаком для данного вида, в) цвет­ной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода. Дифференциально-диагностические среды широко использу­ют в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бак­терий.

Культивирование бактерий применяют, в частности, для выделения и идентификации чистых культур

а Выделение чистой культуры бактерий

Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого ма­териала, содержащего, как правило, смесь различных микро­организмов, является одним из этапов любого бактериологи­ческого исследования, проводимого с различными целями: диагностики заболеваний, определения микробной обсемененности окружающей среды и т.д.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному при­знаку на биологические варианты - биовары. Биовары, разли­чающиеся по биохимическим свойствам, называют хемовара ми, по антигенным свойствам - сероварами, по чувствитель­ности к фагу - фаговарами и т.д. Культуры микроорганизмов одного и того же вида или биовара, выделенные из различных источников либо в разное время из одного и того же источни­ка, называют штаммами , которые обычно обозначают номера­ми, какими-либо символами.

Колония представляет собой видимое изолированное сооб­щество микроорганизмов одного вида, образующееся в резуль­тате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее).

Методы выделения чистой культуры

Для выделения чистой культуры применяют методы, ос­нованные на:

механическом разобщении бактериальных клеток;

предварительной обработке исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказыва­ющими избирательное антибактериальное действие;

избирательном подавлении размножения сопутствую­щей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов;

способности некоторых бактерий быстро размножать­ся в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопробы).

Основные среды .

Пептонный бульон . Выпускается в сухом виде; состав (г/л): триптический гидролизат кильки; натрия хлорид - 4,95.

Питательный агар. Состав (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей - 12,0; агар - 12,5; натрия хлорид 5,5; рН 7,3+0,1.

основные сложные среды -кровяные, сывороточные . Их готовят путем добавления к питательному ашру 5-10 % дефибринированной крови или сыворотки крови либо 25 % асцитической жидкости. Для приготовления ЖИДКОЙ среды такие же количества сыворотки или асцитической жидкости добавляют к питательному бульону. «Агар Мюллера-Хинтон (основная плотная питательная среда для определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков): на 1 л дистиллированной воды мясного настоя (из говядины), 17,5 г гидролизата казеина, Уф г крахмала, 17 г агар-агара.

Элективные питательные среды. Пептонная вода 1 %, рй 8,0. Избирательная для холерного вибриона, который размножается быстро, опережая рост других микроорганизмов. Щелочная реакция среды не препятствует росту возбудителя холеры Vibrio cholerae , но тормозит рост других микроорганиз­мов.

Щелочной агар (плотная среда): питательный агар, рН 7,8, аналогично предыдущей среде элективен для V . cholerae . - Среда Леффлера. Смесь 1 части лошадиной сыворотки и 3 частей сахарного бульона, скошенная в пробирках при нагревании в аппарате Коха, элективна для возбудителя диф­терии Corynebacterium diphtheriae .

■УЖелточно-солевой агар (ЖСА). Содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10 %), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает селективность среды для данных микроорганизмов. Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов (фермент расщепляет лецитин куриного желтка, который вносится в рас­плавленный и остуженный до 45 "С питательный солевой агар).

Дифференциально-диагностические среды .

Среды Гисса . К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индика­тор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении угле­водов. Среда при рН 7,2-7,4 бесцветна. При разложении уг­леводов она приобретает красный цвет.

Среда Ресселя. Применяется при изучении биохими­ческих свойств энтеробактерий (шигелл, сальмонелл). Содер­жит питательный агар, лактозу, глюкозу и индикатор бромти-моловый синий. Приготавливают в пробирках по 6-8 мл в виде столбика со скошенной поверхностью. Цвет незасеянной среды травянисто-зеленый. Посев делают штрихом по скошен­ной поверхности и уколом в глубину столбика. Микроорганиз­мы, ферментирующие глюкозу до кислоты, вызывают измене­ние окраски столбика среды из первоначальной травянисто-зе­леной в желтую; скошенная поверхность при этом приобретает синий цвет. Лактозоположительные микроорганизмы (£. со/0 изменяют цвет столбика и скошенной части среды в желтый. Микроорганизмы, образующие щелочь, изменяют цвет среды в синий. Газообразование отмечается в толще столбика среды.

Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который со­стоит из высушенного питательного агара с 1 % лактозы и индикатора - основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или бледно-ро­зовая. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блес­ком; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные ко­лонии.

Среда Плоскирева (бактоагар Ж). Выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, брилли­антовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными со­лями и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и селек­тивной, так как подавляет рост многих микроорганизмов (ки­шечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некото­рых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, пара-тифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные - красные.

Висмут-сульфит агар . Выпускается в сухом виде; со­держит триптический гидролизат кильки, глюкозу, неоргани­ческие соли, бриллиантовый зеленый, агар. Среда предназна­чена для выделения сальмонелл. Дифференцирующие свойства среды основаны на-способности микроорганизмов продуциро­вать H2S, который вступает в реакцию с цитратом висмута и образует соединение черного цвета - сульфит висмута. Среда резко угнетает рост сопутствующей микрофлоры за счет инги-бирующего действия бриллиантового зеленого и сульфита на­трия.

У бактерий реализуются основные функции живого -

Воспроизведение себе подобных индивид

Развитие.

Физиология микроорганизмов изучает жизнедеятельность, метаболизм бактерий, питание, энергию, рост, размножение бактерий и их взаимодействие с окружающей средой.

Химический состав бактериальной клетки.

Бактерии имеют сложное строение. В них представлены и неорганические и органические соединения. Наряду с простыми веществами имеются сложные компоненты

Вода (80-90% бактериальной массы, она может быть свободной и может быть связанная. Вода несет след. Функции -

1) Растворитель всех веществ

2) Вода - источник водородных и гидроксильных ионов

3) Вода также является дисперсионной средой для протекания реакций в клетке

4) Связанная вода придает большую связанность(резистентность) в спорах например к замерзанию и испарению)

v Минеральные вещества - фосфор, медь, железо, калий, кальций, натрий.

1) Входят в структуры клетки.

2) Обеспечивают осмотическое давление

3) Определяют активность фермента

v Нуклеиновые кислоты представлены

1) ДНК(двухцепочечные и несет хранение генетической информации) и

2) РНК(одноцепочечная, представлена информационной, транспортой и рибосомальной и обеспечивает синтез специфического белка) Особенностью ДНК является что сумма оснований Г+Ц у позвоночных 40%, а у бактерий эта сумма варьирует у Гр(+) = 70-80%, а у Гр(-)=28-30%

v Белки у бактерий представлены простыми белками протеинами и сложными соединениями - протеидами - сложное соединения белков. Белки составляют 50% сухого остатка и могут содержать необычные аминокислоты. Белки несут следующие функции -

1) структурную

2) образуют ферментные системы

3) образуют двигательную систему

4) гидрофильность бактерий(смачиваемость)

5) тинкториальные свойства(особенности окраски)

6) специфичность(антигенное свойство)

7) токсичность

8) электрический заряд бактерий, благодаря которому бактерии способны к электрофорезу, т.е. движению в электрическом поле

v Углеводы - представлены моносахарами, дисахарами и полисахарами. Особенностью их является то, что часть углеводов встречается только у бактерий. У Гр(+) - тейхоловые кислоты. Углеводы играют важную роль -

1) Пластический материал

2) Один из основных источников энергии

3) Специфичность

4) Токсичность

v Липиды - могут быть в виде свободных соединений и в комплексе с белками и углеводами. Липиды представлены нейтральными жирами, фосфолипидами и имеются сложные соединения липидов - воска. Воска - это жиро подобные соединения, состоящие из птиацерола(спирта), аминокислот и низшие жирные кислоты. Чем больше восков, тем более патогенная бактерия. Отличаются липиды наличием необычных соединений. У Гр(-) имеется липид А, имеются необычные фосфолипиды, например аминоацил производные. Липиды несут следующие функции -

1) Структурная роль

2) Предают прочность этим структурам

3) Липиды определяют болезнетворность

4) Играют энергетическую роль

5) Определяют специфичность, с липидами связана устойчивость к антибиотикам и липиды определяют резистентность к кислотам

Питание бактерий - это поступление веществ в бактериальную клетку. Поступление веществ в бактериальную клетку контролирует цитоплазматическая мембрана. Она полупроницаема и обладает избирательной проницаемостью. Поступление веществ в клетку определяется следующими механизмами -

1. Простая(пассивная) диффузия. Она идет по градиенту концентрации, за счет их разницы. Так поступает вода, некоторые молекулы.
2. Облегченная диффузия - по градиенту концентрации, без затрат энергии - в ней участвуют белки переносчики пермиазы. Пермиазы на внешней стороне клетки соединяются с субстратом, переносят его в клетку, а там комплекс диссоциирует и субстрат освобождается.
3. Активный транспорт - против градиента концентрации. При этом затрачивается энергия. В нем участвуют связывающие белки, имеющие сродство с субстратом, присоединяют их фермиазы(белок).
4. Транслокация радикала - ферменты вызывают на поврености клетки модификацию молекул углевода. Происходит ее фосфолилирование. Затем она присоединяется к фермиазам, переносится и освобождается углевод в виде фосфата.

Механизмы выделения веществ из клетки.

Бактериальная клетка выделяет продукты метаболизма, ферменты, токсины. Эти вещества выделяются различными механизмами.

1. Прямой транспорт. Через мембрану перемещается белок-предшественник, который состоит из выделяемого вещества и сигнального пептида. На поверхности мембраны пептидазами пептид отрезается и выделяется то вещество, которое должно выйти из бактериальной клетки
2. Сигнальный транспорт - сигнальный пептид взаимодействует с рецепторами цитоплазматической мембраны, образуются канальцы, по которым вещества выделяются.

Классификация бактерий по способу питания

1. По источнику углерода

2. По источнику энергии

• Фототрофы - используют энергию солнечного света
• Хемотрофы - используют энергию химических реакций.

3. По донору электронов

• Литотрофы - источник электронов - неорганические соединения
• Органотрофы - источник электронов - органические вещества

Стафилококк - хесоорагногетеротроф.

Питательные среды для бактерий. Используют для получения чистых культур

Питательные среды по происхождению бывают

• Естественные - человек, мясо, фрукты
• Искусственные - среды, полученные путем смешивания и обработки естественных сред

По составу питательные среды могут быть

• Простые - это среды, на которых растут большинство бактерий и которые являются основой для других сред. К простым средам относятся МПБ и МПА(мясо-пептоный бульон и агар) МПБ готовится из мясного бульона, обрабатывается ферментом пепсином. Образуется продукт неполного расщеплении белков - пептон, где до 70%свободных аминокислот)
• Сложные - содержат различные биологические добавки или сыворотки, химические соединения, антибиотики. По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Уплотнителем питательных сред является агар-агар - полисахарид из водорослей, он не переваривается ферментами бактерий, уплотняется при температуре 36-40 градусов

По назначению питательные среды могут быть

1. Среды обогащения - это среды, на которых одни виды получают преимущество для развития. Например щелочной огар - возбудитель холеры.
2. Элективные среды - на них хорошо развиваются определенные виды микроорганизмов, например для стаффилокока желточно - солевой агар в присутствии соли стафиллокок хорошо развивается.
3. Дифференциально-диагностические среды - это среды, на которых может отдифференцировать один вид микроорганизма, от другого. К этим средам относятся среды, на которых дифференцируются бактерии по ферментативным свойствам. Среды Гиса, Эндо, Пестреля

Среда Эндо - содержит МПА, 1% лактозы и индикатор фуксин, обесцвеченные фуксидом натрия, используется для дифференцировки бактерий кишечной группы по отношению к лактозе. Если лактоза расщепляется, образуется кислота, в которой фуксин в присутствии кислоты восстанавливается, образуются колонии красного цвета. Если лактоза не расщепляется то кислота не образуется, колонии бесцветные.

1. Комбинирвоанные среды - среда Левина
2. Консервирующие среды - предотвращают отмирание бактерий, например среды с глицерином

Параметры питательных сред.

1. Питательные среды должны иметь определенную концентрацию ионов водорода. Для большинства бактерий ph близкая к 7.

2. Питательная среда должна иметь воду и определенное осмотическое давление

3. В питательной среде должны быть источники углерода.

4. Питательная среда должна содержать серу и азот

5. Должен быть или его должно не быть Кислород.

6. Химические элементы. Обычно эти элементы добавляют в виде солей.

7. Питательная среда должна иметь оптимальную температуру. Температура создается в термостатах

8. По отношению к температуре бактерии подразделяются

Тепофилы(оптимальная температура 40-80 градусов)

Психофилы или криофилы(они развиваются при температуре ниже 20)

Мезофиллы (20-42 градуса)

Питательная среда должна содержат факторы роста. Факторы роста - это вещества, которые вводят в бактериальную клетку, эти вещества бактерия сама не способна синтезировать. К таким факторам роста - пурины и пиримидины, витамины.

По потребностях в факторах роста бактерии делятся

1. Прототрофы - не нуждаются в факторах роста
2. Ауксотрофы - они нуждаются в факторах роста

9. Питательная среда должна быть более прозрачной

10. Питательная среда должна быть стерильной

Стерилизация - освобождение объекта от всех форм жизни.

Физические методы - высокая температура, ультразвук, давление, ионизирующие излучение.

Химические методы стерилизации - спирты, кислоты, фенолы, хлористые соединения. Химическим методом чаще всего проводится дезинфекция. Дезинфекция - уничтожение в окружающей среде инфекционных заболеваний.

Механическая стерилизация - фильтрование. Используются мембранные фильтры. Фильтр Зейца. Состоит из 2х частей. При фильтровании могут пройти вирусы.

Контроль стерилизации.

Методы контроля стерилизации -

1. Химические методы. Используют вещества с точкой плавления выше 100 градусов - сера(119 градусов)
2. Использование термопленки. Меняют цвет при достижении определенной температуры
3. Биологический. Параллельно стерилизуют тест культуру спорообразующую и если спора не прорастает то стерилизация эффективна.

Дыхание бактерий - это получение энергии - окислительно-востановительный процесс с образованием энергии, который накапливается в АТФ. При окислительно-восстановительном процессе электроны переносятся от донора к акцептору. При этом выделяется энергия, синтезируется АТФ, а перенос электронов осуществляют дыхательные ферменты, формирую дыхательную цепь.

У бактерий выделяют 2 механизма дыхания - аэробный механизм дыхания. Акцептором электронов является кислород.

Анаэробный механизм - акцептором электронов являются неорганические соединения(нитраты, сульфаты)

В зависимости от характера дыхания проводится классификация бактерий по типу дыхания. Выделяют следующие типы бактерий

1. Облигатные - строгие аэробы. 21% кислорода в атмосферном воздухе. Примером могут быть - туберкулезная палочка, возбудитель холеры.

2. Облигатные анаэробы - они развиваются в безкислородных условиях. Облигатными аэробами могут быть возбудители столбняка, газовой гангрены.

3. Факультативные анаэробы или аэробы. Примером таких бактерий может быть кишечная палочка.

4. Микроаэрофилы - нуждаются в 1% кислорода - молочно-кислая бактерия.

5. Капнеические микроорганизмы - нуждаются в повышенной концентрации углекислого газа и в пониженной кислорода. Примером являются бруцеллы.

Рост и размножение бактерий.

Рост - это согласованное увеличение всех компонентов клетки. Результатом роста является размножение бактерий.

Размножение бактерий - увеличение числа бактерий, популяции. В процессе роста бактериальная клетка увеличивается в 2-3 раза, она интенсивно окрашивается и накапливается РНК. В благоприятных условиях рост заканчивается размножением. У бактерий размножение происходит делением пополам - бинарное деление. Это основной способ размножения у бактерий.

Размножение бактерий. Начинается с репликации - удвоения генома, а затем происходит деление. У бактерий вегетативная репликация т.е. информация передается от родительской клетки к дочерней.

У бактерий репликация саморегулируемая, так в геноме имеются гены, ответственные за репликацию, т.е. саморегулиремый процесс.

Репликация носит полуконсервативный характер. То есть дочерние клетки получают равномерно распределяющийся генетический материал. Репликация начинается с определенной точки - локус ДНК. От этой точки происходит раскручивание нитей ДНК, образуется репликационная вилка, синтезируется SSB белок, который препятствует повторному скручиванию нитей. Процесс осуществляется ДНК полимеразой, которая способна присоединять комплиментарные нуклеотиды к свободному 3”концу. Синтез комплиментарных участков запускается заправкой праймером. Это участок РНК, комплиментарный матричной ДНК и у праймера имеется свободный 3’ конец. Заправка праймером запускает синтез ДНК, на матрице строятся фрагменты ДНК(оказаки), которые сшиваются в единую нить ДНКлигазами. В бактериальной клетке образуются 2 идентичные нити ДНК, которые растаскиваются по полюсам клетки и после репликации запускается деление бактерий. Оно начинается с удлинения цитоплазматической мембраны, она удлиняется, формируется межклеточная перегородка по экватору, по которой бактерия бинарно делится и образуются 2 идентичные дочерние клетки.

Показатели роста и размножения бактерий.

1. Увеличение размеров клетки,
2. Концентрация бактерий - число клеток в 1 мл.
3. Плотность бактерий - масса бактерий в мг на мл
4. Время генерации - время, за которое число клеток удваивается.

Методы изучения данных показателей -

1. Измерение бактерий с помощью окуляр - микрометра. В ней шкала, по которой измеряется величина бактерий. Подсчет числа клеток в счетных камерах.
2. Нефилометрический метод - изучается мутность взвеси бактерий
3. Учет бактериальной массы путем взвешивания.
4. Рост и размножение бактерий в определенных условиях среды характеризует кривая роста

Физиология бактерий. Метаболизм бактерий. Питание микроорганизмов. Ферменты бактерий.
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БАКТЕРИЙ

По химическому составу микроорганизмы мало отличаются от других живых клеток.

• Вода составляет 75-85% , в ней растворены химические вещества.
• Сухое вещество 15-25%, в состав входят органические и минеральные соединения

Рис. 13. Клетка делится пополам (фото слева - вначале внутреннее содержимое клетки делится пополам, затем образуется поперечная мембранная перегородка, синтезируется клеточная стенка, завершающая деление). Делящиеся клетки (фото справа).

Бактерии, как правило, характеризуются высокой скоростью размножения. Время деления клетки у различных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 минут у кишечной палочки до 14 часов у микобактерий туберкулеза.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями .

Рис. 14. Колонии кишечной палочки на плотной питательной среде в чашке Петри.
На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности, равномерного помутнения либо осадка .

ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ

Важную роль в обмене веществ микроорганизмов играют ферменты.
Различают:

• эндоферменты – локализуются в цитоплазме клеток;
• экзоферменты – выделяются в окружающую среду.

Биохимические свойства бактерий определяются составом ферментов:

• сахаролитические –расщепление углеводов;
• протеолитические – расщепление белков,
• липолитические – расщепление жиров,

Большинство бактерий и грибов культивируются на естественных и искусственных, плотных и жидких питательных средах, в оптимальных для них условиях. На питательных средах микроорганизмы при размножении образуют определенной морфологии колонии, что определяет их культуральные свойства .
Идентификацию бактерий в исследуемом материале проводят на основании определения морфологических, биохимических, культуральных и других свойств микроскопическими, микробиологическими и другими методами исследования.
Усваиваемые бактериальной клеткой соединения. Пути поступления веществ в бактериальную клетку. Пассивный перенос. Диффузия. Основные соединения, усваиваемые бактериальной клеткой , - углеводы, аминокислоты, органические кислоты, жирные кислоты, минеральные вещества, витамины и др. Бактериям совершенно безразличны источники питательных веществ; образно говоря, они «лишены вкуса и не страдают несварением желудка». Более того, бактерии иногда утилизируют вещества, не пригодные для животных клеток (например, карболовую кислоту, парафин, мыло и др.).
Подобно прочим формам жизни, бактерии нуждаются в одних и тех же макроэлементах - С, Н, О, N, P, S, К, Са, Mg, Fe. Микроэлементы (следовые элементы) - Mn, Mo, Zn, Си, Со, Ni, Va, В, С], Na, Se, Si, Wo - не нужны каждому организму, но бактериям они необходимы для синтеза коферментов либо поддержания специфического тина метаболизма. Например, для оптимального роста некоторые бактерии нуждаются в высоких концентрациях Na+; их называют галофилами [от греч. hals, соль]. Помимо источников углерода, энергии и элементов минерального питания, многие микроорганизмы нуждаются в некоторых дополнительных веществах, называемых факторами роста. Количественная потребность в питательных элементах и их содержание у различных бактерий варьируют, но принципиально химический состав бактериальной клетки сходен с другими живыми клетками (исключением является отсутствие у бактерий стеролов).
Пути поступления веществ в бактериальную клетку Для того чтобы питательные вещества могли подвергнуться соответствующим превращениям в клетке, они прежде всего должны в неё проникнуть. Но большинство бактерий обитает в условиях, мало пригодных для поддержания строгих соотношений воды, неорганических и органических веществ, без которых их жизнь просто невозможна. Клеточная стенка бактерий не. является существенным барьером для небольших молекул и ионов, но задерживает макромолекулы. Истинный барьер, обеспечивающий избирательное поступление веществ в клетку, - ЦПМ. Она проницаема для одних веществ и непроницаема для других. Потоки веществ движутся в обоих направлениях (внутрь и наружу). Эти перемещения обеспечивают разнообразные транспортные системы, необходимые для выполнения двух важнейших задач.
1. Обеспечение адекватных концентраций веществ , участвующих в основных биохимических реакциях, в том числе и обеспечение, при необходимости, их быстрого поступления внутрь клетки, невзирая на концентрацию этих веществ в окружающей среде.
2. Поддержание осмотического давления , оптимального для протекания биохимических реакций. Поступление различных веществ внутрь бактериальной клетки реализуют три механизма: пассивный перенос, активный перенос и транспорт, обусловленный фосфорилированисм.
Механизмы транспорта через цитоплазматическую мембрану .
Пассивный перенос веществ в бактериальную клетку Многие вещества способны неспецифически проникать в бактериальную клетку за счёт различия их концентраций по обе стороны ЦПМ. При этом они поступают в клетку только до выравнивания градиента концентрации с внешним раствором. Такое поступление веществ происходит пассивно, без прямых энергетических затрат. Существует два вида пассивной диффузии: простая и облегчённая.
Простая диффузия . Проникновение веществ носит неспецифический характер и целиком зависит от размеров молекул и их липофильности. Скорость подобного переноса незначительна.
Облегчённая диффузия . Механизм транспорта носит аналогичный характер, но проникновение облегчают помощники - специфические мембранные белки-пермеазы, способствующие прохождению различных молекул через ЦПМ. Транспорт сопровождается образованием комплекса «вещество-пермеаза». После преодоления ЦПМ комплекс диссоциирует, а перме-аза используется для последующего «проведения» других молекул. Подобный тип транспорта реализуется по градиенту концентрации и характерен для эукариотов при поглощении Сахаров.
У прокариотов единственный пример облегчённой диффузии - проникновение глицерина в клетки бактерий кишечной группы. При этом концентрация проникшего глицерина практически равна его концентрации в окружающей среде. В последующем (в результате реакций фосфорилирования) глицерин трансформируется в глицерин-3-фосфат.
Фермент. Ферменты бактерий. Регуляторные (аллостерические) ферменты. Эффекторные ферменты. Определение ферментативной активности бактерий. Все питательные вещества и любые элементы, подвергающиеся взаимодействиям и превращениям с участием бактерий, вступают в реакции при участии ферментов. Ферменты [от лат. fermentum, закваска], или энзимы [от греч. enzyme, дрожжи или закваска], - специфичные и эффективные белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. За каждое превращение одного соединения в другое ответственен особый фермент.
Ферменты снижают энергию активации , обеспечивая протекание таких химических реакций, которые без них могли бы проходить только при высокой температуре, избыточном давлении и при других нефизиологических условиях, неприемлемых для живой клетки.
Ферменты увеличивают скорость реакции примерно на 10 порядков, что сокращает полупериод какой-либо реакции с 300 лет до одной секунды.
Ферменты «узнают» субстрат по пространственному расположению его молекулы и распределению зарядов в ней. За связывание с субстратом отвечает определённый участок молекулы ферментативного белка - его каталитический центр. При этом образуется промежуточный фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с образованием продукта реакции и свободного фермента.
Регуляторные (аллостерические) ферменты Регуляторные (аллостерические) ферменты воспринимают различные метаболические сигналы и в соответствии с ними изменяют свою каталитическую активность.
Эффекторные ферменты Известно шесть основных классов ферментов, катализирующих следующие реакции: оксидоредуктазы - перенос электронов; трансферазы - перенос различных химических групп; гидролазы - перенос функциональных групп на молекулу воды; лиазы - присоединение групп по двойным связям и обратные реакции; изомера-зы - перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм; лигазы - образование связей С-С, C-S, С-О, C-N за счёт реакций конденсации, сопряжённых с распадом аденозинтрифосфата (АТФ).
Бактерии способны синтезировать все ферменты , необходимые для утилизации широкого спектра питательных субстратов. Определённый субстрат в среде вызывает синтез ферментов, обеспечивающих его катаболизм. В этом случае говорят об индукции катаболических ферментов индуцирующим субстратом (иидуцибельные ферменты). Образование анаболических ферментов в процессах биосинтеза регулируется путём репрессии конечным продуктом (репрессибельные ферменты). Если в среде имеются одновременно два субстрата, то бактерия использует субстрат, обеспечивающий более быстрый рост. Синтез ферментов для расщепления второго субстрата репрессируется; такой вариант известен как катаболитная репрессия. Ферменты, синтезируемые вне зависимости от условий среды, - конститутивные ферменты.
Определение ферментативной активности бактерий Определение ферментативной активности бактерий играет огромную роль в их идентификации. Например, все аэробы или факультативные анаэробы обладают супероксид дисмутазой и каталазой - ферментами, защищающими клетку от токсичных продуктов кислородного метаболизма. Практически все облигатные анаэробы не синтезируют эти ферменты. Только одна группа аэробных бактерий - молочнокислые бактерии каталазонегативны, но аккумулируют пероксидазу - фермент, катализирующий окисление органических соединений под действием Н202 (восстанавливается до воды). Наличие аргининдигидролазы - диагностический признак, позволяющий различить сапрофитические виды Pseudomonas от фитопатогенных. Среди пяти основных групп семейства Enterobacteriaceae только две - Escherichiae и Erwiniae- не синтезируют уреазу. Часто вирулентность штамма связана с повышенной активностью ферментов, ответственных за синтез токсинов.
Получение микробных ферментов - важнейшая отрасль промышленной микробиологии. Например, для улучшения пищеварения применяют готовые препараты ферментов - амилазы, целлюлазы, протеазы, липазы, облегчающих соответственно гидролиз крахмала, целлюлозы, белка и липидов. При изготовлении сладостей для предупреждения кристаллизации сахарозы применяют инвертазу дрожжей, для осветления фруктовых соков - пектиназу. Коллагеназа клостридий и стрептокиназа стрептококков, гидролизующие белки, способствуют заживлению ран и ожогов. Литические ферменты бактерий, секретируемые в окружающую среду, действуют на клеточные стенки патогенных микроорганизмов и служат эффективным средством в борьбе с последними, даже если они обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. В качестве инструментария в биоорганической химии, генной инженерии и генотерапии используют выделенные из бактерий рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, полимеразы, ДНК-лигазы и прочие ферменты, направленно модифицирующие нуклеиновые кислоты.